PCR (polymerase chain reaction)

Biologi A · STX · A-niveau · Bioteknologi

🧬 PCR (polymerase chain reaction)

PCR = Polymerase Chain Reaction. Opfundet af Kary Mullis 1983 (Nobelpris 1993). Kopierer en specifik DNA-sekvens millioner af gange på få timer — "molekylærbiologiens fotokopimaskine".

Princip: 3 trin gentages 25-35 gange i thermocycler.

1.

Denaturering (94-98 °C, 30 sek): DNA-dobbeltstrengen smelter til to enkeltstrenge.

2.

Annealing (50-65 °C, 30 sek): primere binder til de specifikke målsekvenser på enkeltstrengene. Primere er korte (~20 nt) syntetiske DNA-stykker der definerer hvor PCR'en starter.

3.

Elongation (72 °C, 30 sek - flere min): Taq-polymerase (fra termofile bakterien Thermus aquaticus) syntetiserer ny DNA-streng komplementært til template.

Eksponentiel amplifikation: efter n cykler er der 2ⁿ kopier. 30 cykler → ~10⁹ kopier af én startmolekyle.

Komponenter: template-DNA, to primere (forward og reverse), dNTPs (deoxynukleotidtriphosphater — A, T, G, C), Taq-polymerase, Mg²⁺ (kofaktor), buffer.

Anvendelser

COVID-19 PCR-test (RT-PCR for RNA-virus), retsmedicin (DNA-fingerprint fra små prøver), paternitetstest, arkæologi (gammelt DNA), prænatal diagnostik. qPCR (real-time/quantitative PCR): måler PCR-produkt under kørsel — kan kvantificere hvor meget startmateriale der var.

RT-PCR (reverse transcription): bruges når man starter med RNA — først omdannes RNA til cDNA via revers transcriptase.

Skoleforsøg

bruge PCR til at amplificere et specifikt gen (fx GAPDH "housekeeping"-genet) fra menneskelig DNA, derefter visualisere resultatet med gel-elektroforese for at bekræfte, at fragmentet har den forventede størrelse.

Læringsmål

• Forklare PCR-metoden
• Anvende gel-elektroforese til DNA-analyse
• Forklare CRISPR-Cas9 (gen-redigering)
• Diskutere etiske aspekter af GMO
• Anvende restriktionsenzymer

Sådan kan du arbejde med emnet

• Forklar formålet med de tre trin i en PCR-cyklus (denaturering, annealing, elongering)
• Beregn, hvor mange kopier af et DNA-fragment man har efter 8 PCR-cyklusser, hvis man starter med én kopi
• Diskutér, hvilke krav der stilles til primerne for, at en PCR-reaktion fungerer korrekt

Eksperiment-forslag

• Beregn, hvor mange kopier af et DNA-fragment der dannes efter 20, 25 og 30 PCR-cykler, ud fra formlen 2ⁿ.
• Lav et flowdiagram over de 3 PCR-trin (denaturering, annealing, elongation) med temperaturer og tidsangivelser for hvert trin.
• Forklar forskellen på PCR og RT-PCR — hvorfor var RT-PCR afgørende for at kunne teste for SARS-CoV-2 (et RNA-virus)?

Brobygning

Når DNA kan kopieres og analyseres i store mængder, åbner det for præcis redigering af generne selv — det undersøges i 'CRISPR-Cas9 (gen-redigering)'.