ELISA (immunassay)

Bioteknologi A · STX · A-niveau · Medicinsk bioteknologi

🧫 ELISA — den klassiske immunassay

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) er en af bioteknologiens vigtigste tests. Den detekterer specifikke proteiner eller antistoffer i prøver — fundament for HIV-test, graviditetstest, allergi-test og COVID-19-antistoftest.

Hvad er ELISA?

Princip: brug antistoffer til at "fange" eller "mærke" specifikke molekyler.

• Opfundet ~1971
• Følsomhed: ned til picogram-niveau (10⁻¹² g)
• Standard i klinisk diagnostik
• Plate med 96 brønde kører mange prøver parallelt

De 4 grundtyper

#### 1. Direkte ELISA

Simplest form:

1. Antigen klæbes til brønden

2. Enzym-konjugeret antistof binder direkte

3. Tilføj substrat → farveskifte

Fordel: hurtig, simpel

Ulempe: mindst følsom

#### 2. Indirekte ELISA

Mest følsom:

1. Antigen i brønden

2. Primær antistof binder antigen

3. Sekundær enzym-konjugeret antistof binder primær

4. Substrat → farve

Fordel: mest følsom

Brug: HIV-tests, COVID-antistoftests

#### 3. Sandwich ELISA

Kvantitativ måling:

1. Fanger-antistof klæbes til brønden

2. Antigen tilføjes — binder fanger-antistof

3. Detekter-antistof (med enzym) binder antigen

4. Substrat → farve

Fordel: meget specifik, kvantitativ

Brug: hormon-tests (insulin, hCG)

#### 4. Konkurrence ELISA

For små molekyler:

1. Prøve-antigen + kendt enzym-mærket antigen

2. De konkurrerer om bindingssteder

3. Mere prøve-antigen → mindre mærket bindes → mindre farve

Brug: små molekyler (steroider, lægemidler)

Enzymer og substrater

#### Typiske enzymer

• HRP (Horseradish Peroxidase) — fra peberrod
• AP (Alkaline Phosphatase)

#### Substrater

Enzymet omdanner et kromogent substrat → farvet produkt:

• HRP + TMB → blå farve
• AP + pNPP → gul farve

#### Detektion

• Spektrofotometer måler absorbans (typisk 450 nm)
• Farve-intensitet ∝ mængde af antigen
• Kvantitativ måling

Anvendelser

#### HIV-screening

• Detekterer anti-HIV antistoffer
• Bekræftet med Western blot eller PCR
• Vinduesperioden: 3-12 uger efter infektion

#### Graviditetstest

• Detekterer β-hCG (humant choriongonadotropin)
• Produceret af placenta
• Hjemmetests bruger papirstrip-ELISA

#### Allergi-tests

• Detekterer IgE-antistoffer mod specifikke allergener
• Peanut, mælk, æg, gluten, pollen, husstøvmider
• Erstatter ofte prick-tests

#### COVID-19 antistoftest

• Efter infektion eller vaccine
• Detekterer anti-spike eller anti-nukleokapsid antistoffer
• Forskel mellem infektion og vaccine

#### Fødevarekontrol

• Allergi-detektion i produkter (peanut, mælk, gluten)
• Hormon-rester i kød
• Aflatoxiner i kornprodukter

#### Narkotikatests

• Detekterer stoffer eller deres metabolitter
• Brugt i arbejdsplads-tests, retsmedicin

#### Forskning

• Cytokin-måling
• Protein-niveauer i serum
• Diagnose af sjældne sygdomme

Praktisk procedure

#### En typisk ELISA tager ~90 minutter:

1. Klæbning (coating): 1-12 timer (ofte over natten)

2. Blokering: 30 min (forhindrer uspecifik binding)

3. Antigen/antistof-binding: 30-60 min

4. Vask: 3-5 gange

5. Detektion-antistof: 30 min

6. Vask: 3-5 gange

7. Substrat: 10-30 min

8. Stop og aflæsning

Pålidelighed

#### Sensitivitet

• Hvor god er testen til at finde positive?
• HIV ELISA: >99% sensitivitet

#### Specificitet

• Hvor god er testen til at udelukke negative?
• HIV ELISA: >99% specificitet

#### Falske positive

• Især vigtigt ved sjældne sygdomme
• Bayes' formel viser, at selv en 99% præcis test kan have lav PPV ved sjælden sygdom

Nyere udvikling

#### Multiplex ELISA

• Detekterer mange antistoffer/proteiner i én test
• Op til 100+ samtidig
• Bruges i autoimmune sygdomme

#### Lateral Flow Assay

• "Strip-test" version (graviditetstest, COVID-hjemmetest)
• Hurtig, simpel
• Mindre præcis end klassisk ELISA

#### Bio-chip og microarray

• Helt automatisk
• Lille volumen
• Høj gennemløb

Historisk perspektiv

• Rosalyn Yalow og Solomon Berson udviklede radioimmunoassay (RIA) — forgænger til ELISA
• Yalow vandt Nobelprisen 1977 (Berson var død i 1972)
• Engvall og Perlmann udviklede ELISA i 1971 (sikkert alternativ til radioaktivitet)
• ELISA har erstattet RIA på de fleste områder

Vidste du at...

🩸 Verdens første HIV-screening brugte ELISA — det reddede transfusions-modtagere fra at få HIV gennem blod.

🤰 Hjemme-graviditetstest er en simpel lateral flow ELISA — pis på et strip, og 2 streger viser positiv. Strip'en koster ~5 kr at producere men sælges for 30-50 kr.

🍔 Fødevareindustrien bruger ELISA dagligt til at sikre, at allergener (peanut, gluten) IKKE er kontamineret i andre produkter — kan redde liv.

Læringsmål

• Forklare PCR-tests og ELISA i diagnostik
• Forklare rekombinant insulinproduktion (E. coli, gær)
• Forklare monoklonale antistoffer mod kræft
• Forklare mRNA-vacciner (Pfizer-BioNTech, Moderna)
• Diskutere personlig medicin og pharmacogenomics

Sådan kan du arbejde med emnet

• Forklar princippet bag en ELISA-test
• Beskriv, hvordan farveomslag i en ELISA-test bruges til at detektere et antigen eller antistof
• Diskutér, hvilke fordele ELISA har i forhold til andre diagnostiske metoder

Eksperiment-forslag

• Tegn de 4 ELISA-typer (direkte, indirekte, sandwich, konkurrence) som diagrammer, og forklar hvornår hver type bruges.
• Brug Bayes\' formel til at beregne den positive prædiktive værdi (PPV) af en 99% præcis test for en sjælden sygdom (fx 1/10.000) — diskutér hvad resultatet betyder for tolkning af tests.
• Sammenlign en hjemme-graviditetstest (lateral flow) med en laboratorie-ELISA — hvilke kompromiser er lavet for hastighed/pris?

Brobygning

Hvor ELISA identificerer proteiner og antistoffer, bruger retsmedicin en anden molekylær teknik til at identificere PERSONER — næste emne er 'DNA-fingerprint (retsmedicin)'.