PCR (polymerase chain reaction)

Bioteknologi A · STX · A-niveau · Genteknologi

🧫 PCR (polymerase chain reaction)

PCR (Kary Mullis 1983, Nobelpris 1993) amplificerer DNA-fragmenter eksponentielt.

Komponenter: target-DNA (template), 2 primere (~20 bp komplementære til flankerende regioner), Taq-polymerase (varmestabil, fra Thermus aquaticus), 4 dNTP (A, T, G, C), buffer med Mg²⁺. Cyklus (30-40 gentages):1. Denaturering 95°C 30s — DNA-strenge separeres;

2. Annealing 55-65°C 30s — primere binder;

3. Extension 72°C 60s — Taq syntetiserer komplementær streng. Eksponentiel amplifikation: 2ⁿ kopier efter n cykler (1 → 2 → 4 → ... → ~10⁹ efter 30 cykler).

Anvendelser: COVID-19 RT-PCR (mRNA → cDNA → PCR), DNA-fingerprint, GMO-detektion, paternitetstest, fosterdiagnostik, genekspression (qPCR), kloning.

Variants: RT-PCR (RNA-tilbageskrivning), qPCR (kvantitativ, real-time med fluorescens), nested PCR, multiplex PCR. Termocycler-apparat udfører cykler automatisk.

Vidste du at...

🦠 PCR-testen blev navet i alles hjem under COVID-19 — kunne detektere én enkelt SARS-CoV-2-partikel i en prøve!

🌋 Taq-polymerase kommer fra bakterier i hot springs i Yellowstone — opdaget 1969. Uden den ingen PCR.

🏆 Kary Mullis fik Nobelprisen i kemi 1993 — han fik idéen mens han kørte bil til en weekend-tur!

Læringsmål

• Forklare PCR (polymerase chain reaction) trinvist
• Anvende gel-elektroforese og restriktionsenzymer
• Forklare CRISPR-Cas9 og guide-RNA
• Forklare plasmid-vektorer og kloning
• Diskutere etiske aspekter af gen-redigering og GMO

Sådan kan du arbejde med emnet

• Forklar formålet med de tre trin i en PCR-cyklus (denaturering, annealing, elongering)
• Beregn, hvor mange kopier af et DNA-fragment man har efter 10 PCR-cyklusser, hvis man starter med én kopi
• Diskutér, hvilke krav der stilles til primerne for, at en PCR-reaktion fungerer korrekt

Eksperiment-forslag

• Beregn antallet af DNA-kopier efter 20, 30 og 40 PCR-cykler ud fra formlen 2ⁿ, og diskutér hvorfor for mange cykler kan give uspecifikke produkter.
• Tegn en temperaturkurve for én PCR-cyklus (denaturering, annealing, extension) med tider og temperaturer, og forklar hvad der sker med DNA\'et i hvert trin.
• Design primer-krav til et tænkt PCR-forsøg: hvorfor skal primere være ~20 bp, ikke binde hinanden, og være specifikke for target-sekvensen?

Brobygning

Når man ikke bare vil amplificere DNA, men også måle HVOR MEGET der er til stede i realtid, bruges en videreudvikling af PCR — næste emne er 'qPCR og RT-PCR'.