Plasmid-transformation (E. coli + GFP)

Bioteknologi A · STX · A-niveau · Eksperimentelt arbejde

🧫 Plasmid-transformation (E. coli + GFP)

Plasmid-transformation er en af biologiens klassiske gymnasieforsøg — du indfører fremmedt DNA i en bakterie og får den til at producere et nyt protein. Det er gentech i praksis — og den standardteknik som har skabt alt fra insulin til moderne lægemidler.

Prokaryoter — værterne

Prokaryoter (bakterier + archaea) er encellede organismer uden cellekerne. Størrelse: ~1-10 µm. Hovedfeatures:

Cellevæg:

• Gram-positive: tyk lag af peptidoglykan
• Gram-negative: tynd lag + ydre membran med lipopolysakkarider (LPS)

Plasmamembran: indeholder respirationsenzymer (de har ingen mitokondrier!)

Cytoplasma: indeholder 70S-ribosomer (mindre end eukaryote 80S — derfor virker antibiotika selektivt mod bakterier)

Nukleoid: cirkulært kromosom-DNA, IKKE histon-pakket (i modsætning til eukaryot DNA)

Plasmider — bakteriens "ekstra-DNA"

Plasmider er små cirkulære ekstrakromosomale DNA-molekyler (1-300 kb) der:

• Bærer accessoriske gener (ofte antibiotika-resistens, virulens)
• Kan replikeres uafhængigt af det store kromosom
• Kan overføres mellem bakterier (konjugation)
• Er molekylærbiologiens favorit-vektorer

Hvorfor er plasmider perfekte vektorer?

• Små og lette at manipulere
• Selvkopierende
• Har selektion-markører (antibiotika-resistens)
• Har multiple cloning sites (MCS) til indsætning af gener

Klassiske strukturer

| Struktur | Funktion |

|---|---|

| Flagel | Bevægelse (svømmer) |

| Pili | Kontakt + DNA-overførsel (konjugation) |

| Kapsel | Slim, beskytter mod fagocytose |

| Endospore | Overlevelse (Bacillus, Clostridium) |

Reproduktion

Bakterier formerer sig ved binær fission — én celle deler sig i to identiske datterceller.

Generationstid:

• E. coli: 20 min (under ideelle forhold)
• Mycobacterium tuberculosis: 24 timer

E. coli kan på 8 timer producere 16 mio. afkom fra én celle!

Plasmid-transformation — protokollen

Det klassiske gymnasieforsøg med E. coli + GFP-plasmid:

1. Klargør plasmidet

F.eks. pGLO-plasmid med:

• GFP-gen (Green Fluorescent Protein — lyser grønt under UV!)
• Ampicillin-resistens-gen
• Arabinose-promotor (kontrolleret udtryk)

2. Forbered kompetente celler

• E. coli-kultur i log-fase
• Behandl med CaCl₂ → cellerne bliver "permeable"
• Hold på is

3. Mix og varmechok

• Tilsæt plasmid til celler
• Hold på is i 30 min
• Heat shock 42°C i 90 sekunder
• Tilbage på is

4. Recovery

• Tilføj næringsmedium
• Inkuber 1 time ved 37°C

5. Selektion

• Spred på agar med ampicillin
• Kun transformerede celler overlever (de har ampicillin-resistens fra plasmidet)
• Tilføj arabinose → GFP-gen aktiveres

6. Visualisering

• Sæt UV-lampe på pladen → kolonier lyser grønt! 🟢

Hvad lærer du af forsøget?

• Hvordan fremmedt DNA kan indføres i celler
• Hvordan selektions-markører virker
• Hvordan regulering af gener fungerer (arabinose-system)
• Hvordan fluorescerende proteiner bruges som markører
• Etiske spørgsmål om GMO

GFP og Nobel

GFP (Green Fluorescent Protein) kommer fra gople-arten Aequorea victoria. Det blev opdaget af Osamu Shimomura og videreudviklet til universelt biologisk værktøj af Martin Chalfie og Roger Tsien.

Nobelprisen i kemi 2008 gik til alle tre for opdagelsen og udviklingen af GFP.

Vidste du at...

🦠 E. coli K-12 er den mest studerede bakterie nogensinde — der findes hele stamtræer af labstamme-varianter.

💊 Det første rekombinante lægemiddel var insulin produceret af E. coli (HUMULIN, 1982) ved samme princip som GFP-forsøget.

🌈 Der findes nu mange fluorescerende proteiner i alle regnbuens farver — CFP (cyan), YFP (yellow), RFP (red), mCherry. De bruges til at mærke specifikke proteiner i levende celler.

Læringsmål

• Forklare rekombinant DNA-teknologi og plasmid som vektor
• Udføre heat-shock-transformation af E. coli med pGLO-plasmid
• Selektere transformanter via ampicillin-resistens og GFP-fluorescens
• Diskutere etiske aspekter ved transformation og GMO-fremstilling

Sådan kan du arbejde med emnet

• Forklar trinene i en transformation af E. coli med et plasmid, der indeholder GFP-genet
• Beskriv, hvordan man kan afgøre, om transformationen er lykkedes
• Diskutér hvilken rolle et selektionsmarkørgen (fx antibiotikaresistens) spiller i et plasmid

Eksperiment-forslag

• Gennemfør (eller gennemgå) pGLO-transformationsforsøget trin for trin: kompetente celler, varmechok, recovery, selektion på ampicillin-agar med arabinose.
• Forklar hvorfor kun de transformerede kolonier overlever og lyser grønt under UV — knyt det til selektion-markører og genregulering.
• Diskutér de etiske spørgsmål ved GMO ud fra forsøget — hvad adskiller dette laboratorieforsøg fra fx genmodificerede afgrøder i fødevareproduktion?

Brobygning

Når genet er indsat og udtrykt, kan man måle hastigheden af de enzymreaktioner, det styrer — det fører videre til 'Enzymkinetik (Michaelis-Menten)'.