Spektrofotometri og proteinanalyse

Bioteknologi A · STX · A-niveau · Eksperimentelt arbejde

🧫 Spektrofotometri og proteinanalyse

Spektrofotometri = måling af LYS-ABSORPTION (eller transmission) gennem en prøve. Central biokemisk analyseteknik.

Princip: lys af bestemt bølgelængde sendes gennem prøven. Den absorberede mængde afhænger af koncentrationen af stoffet.

Beer-Lamberts lov: A = ε·c·l, hvor A = absorbans (dimensionsløs), ε = molær extinktionskoefficient (M⁻¹cm⁻¹, karakteristisk for stoffet), c = koncentration (M), l = vejlængde gennem prøve (typisk 1 cm).

Praktisk anvendelse: hvis ε kendes, kan c bestemmes ud fra A.

Spektrofotometer-opbygning: lyskilde → monokromator (vælger bølgelængde) → prøve i kuvette → detektor → display.

Bølgelængder + anvendelser:

• (a) UV (190-380 nm) — proteiner absorberer ved 280 nm (aromatiske aminosyrer trp, tyr, phe). DNA + RNA absorberer ved 260 nm.
• (b) Synligt lys (380-700 nm) — farvede stoffer (chlorofyl ~430+660 nm, hæmoglobin 540+576 nm).
• (c) NIR (>700 nm) — IR-spektroskopi for funktionelle grupper.

Klassiske anvendelser i biokemi:

1.

Bestem DNA-koncentration: A_260 nm × 50 = µg/mL (for dobbelt-streng DNA). For ren DNA: A_260/A_280 ratio ~1,8. Lavere ratio → protein-forurening.

2.

Protein-koncentration: A_280 nm — relativt unøjagtigt (afhænger af aromatiske aminosyrer). Bedre med kemiske metoder (se nedenfor).

3.

Enzymkinetik: følg reaktion ved at måle A vs. tid. Mange enzym-reaktioner ændrer A (NAD/NADH ved 340 nm).

4.

Fotosyntese: chlorofyl absorberer rødt + blåt, reflekterer grønt → planter er grønne (det er det grønne lys, der IKKE absorberes og derfor reflekteres til vores øjne).

Læringsmål

• Forklare Beers lov og spektrofotometriets princip (absorbans, bølgelængde)
• Udføre Bradford- eller BCA-assay til proteinkvantificering
• Tolke absorbansspektre og opstille kalibreringskurver
• Anvende spektrofotometri til enzymatiske reaktioner og cellevækst (OD600)

Sådan kan du arbejde med emnet

• Forklar princippet bag spektrofotometri og hvad absorbans måler
• Beskriv, hvordan man kan bruge spektrofotometri til at bestemme proteinkoncentrationen i en opløsning
• Diskutér hvordan en standardkurve bruges til at omsætte absorbansværdier til koncentrationer

Eksperiment-forslag

• Lav en fortyndingsrække af en farvet opløsning (fx kobbersulfat eller en proteinprøve med Bradford-reagens) og mål absorbansen — tegn en kalibreringskurve (A vs. c) og bestem ε via Beer-Lamberts lov.
• Bestem DNA-koncentration og renhed (A_260/A_280-ratio) for en DNA-prøve, og diskuter hvad en lav ratio kan skyldes.
• Brug spektrofotometri til at følge en enzymreaktion over tid (fx NAD/NADH ved 340 nm) og beregn reaktionshastigheden ud fra hældningen.

Brobygning

Dermed har du et solidt overblik over Bioteknologi A\'s eksperimentelle metoder. Næste kategori er 'Eksamen og prøveformer', der starter med 'Skriftlig prøve — 5 timer, 6-8 opgaver'.